Badanie jałowości wykonuje się w warunkach aseptycznych. W celu ich zapewnienia środowisko badania musi być odpowiednio dostosowane, zależnie od wybranej metodyki. Podejmowanie działania zapobiegające skażeniu nie mogą wpływać na żadne drobnoustroje, które mają być wykryte w badaniu. Warunki pracy, w których prowadzi się badania są regularnie kontrolowane przez pobieranie próbek z obszaru pracy oraz prowadzenie właściwego nadzoru.
Osobny artykuł: Aseptyka i jałowość leku
Należy pamiętać, że przed wyborem sposobu badania jałowości powinniśmy przeprowadzić test przydatności tej metody, z użycie inokulum (próbka mikroorganizmów potrzebna do stworzenia kultury komórkowej) z niewielką ilością zdolnych do życia drobnoustrojów. Badanie jałowości można wykonać metodą z użyciem sączków membranowych lub przez wprowadzenie produktu bezpośrednio do podłoży hodowlanych. Każde badanie zawiera odpowiednie kontrole ujemne. Metodę z użyciem sączków membranowych stosuje się, gdy pozwalają na to właściwości produktu, czyli dla wodnych preparatów dających się sączyć, preparatów alkoholowych i preparatów olejowych lub mieszających się, bądź rozpuszczalnych w wodzie, czy też rozpuszczalnikach olejowych pod warunkiem, że rozpuszczalniki te nie wykazują w warunkach badania działania przeciwdrobnoustrojowego.
Metoda z użyciem sączków membranowych
Należy używać sączków o nominalnej wielkości porów, nie większej niż 0,45 mikrometra, dla których ustalona została skuteczność zatrzymywania drobnoustrojów. Zaleca się stosować sączki wykonane z azotanu celulozy np.: dla roztworów wodnych, olejowych i niskoprocentowych roztworów alkoholowych, a z octanu celulozy dla wysokoprocentowych roztworów alkoholowych. Dla szczególnych produktów takich jak antybiotyki mogą być wymagane specjalne sączki.
Roztwory wodne: tam gdzie jest wskazane, przenieść na sączek małą objętość odpowiedniego, jałowego rozcieńczalnika jak np.: obojętny roztwór peptonu mięsnego lub kazeinowego i przesączyć. Przenieść na sączek zawartość badanego pojemnika w wielkości nie mniejszej niż podanej w poniższej tabeli i natychmiast przesączyć. Jeżeli produkt posiada właściwości przeciwdrobnoustrojowe, przemyć sączek co najmniej trzema porcjami w ilości przyjętej w teście przydatności metody. Następnie przenieść sączek w całości do jednej z pożywek lub po przecięciu w warunkach aseptycznych na dwie równe części do dwóch odpowiednich podłoży.
Oleje i roztwory olejowe: substancje o niskiej lepkości można sączyć bez rozcieńczenia na suche sączki. Oleje lepkie można rozcieńczyć, jeżeli to konieczne np.: mirystynianem izopropylu. Pozostawić olej do przeniknięcia przez sączek ciężarem własnym, a następnie stosując ciśnienie i podciśnienie. Przemyć sączek minimum trzykrotnie z użyciem odpowiedniego jałowego rozcieńczalnika z dodatkiem odpowiedniego emulgatora np.: sorbatu80. Po wykonaniu tej czynności sączek należy przenieść na odpowiednie podłoże i inkubować.
Maści i kremy: Podobne postępowanie jak dla roztworów olejowych.
| Ilość w pojemniku | Minimalna ilość posiewana na każde podłoże |
Mniej niż 1 ml 1 ml-40 ml Więcej niż 40 ml, nie więcej niż 100 ml Więcej niż 100 ml Wodne preparaty antybiotyków |
Cała zawartość pojemnika Połowa zawartości, jednak nie mniej niż 1 ml 20 ml 10% zawartości, jednak nie mniej niż 20 ml 1 ml |
| Rozpuszczalne preparaty, kremy i maści, które zawiesza się lub emulguje | Cała zawartość pojemnika, jednak nie mniej niż 200 mg |
Substancje stałe: Mniej niż 50 mg 50 mg lub więcej, lecz mniej niż 300 mg Od 300 mg do g Więcej niż 5 g |
Cała zawartość każdego pojemnika Połowa zawartości, nie mniej niż 50mg 150 mg 500mg |
Tabela 1. Minimalna ilość posiewana na każde z podłoży.
Metoda bezpośredniego posiewu
Do podłoża hodowlanego wprowadzić bezpośrednio produkt badany w ilości podanej w tabeli, tak aby objętość produkt stanowiła nie więcej niż 10% objętości podłoża, jeżeli nie podano inaczej. Dla płynów olejowych trzeba stosować podłoża z dodatkiem odpowiedniego emulgatora. Maści i kremy należy rozcieńczyć w stosunku 1:10 emulgując w roztworze wybranego emulgatora w jałowym rozcieńczalniku. Przenieść rozcieńczony produkt do podłoża niezawierającego emulgatora. Inkubować posiada podłoża przez okres nie krótszy niż 14 dni. Obserwować hodowle kilkakrotnie w okresie inkubacji. Podłoża zawierające produkty olejowe codziennie łagodnie wstrząsać, chyba, że konieczne jest utrzymanie warunków beztlenowych.
Sprawdź również: Emulsje
Obserwacja i interpretacja wyników
W czasie inkubacji okresowo i końcowo musimy kontrolować podłoże w kierunku pojawienia się widocznego makroskopowo wzrostu drobnoustrojów. Jeżeli nie stwierdza się wzrostu, produkt badany spełnia wymagania badania jałowości. W przypadku stwierdzenia wzrost drobnoustrojów, produkt nie spełnia wymagań jałowości, o ile wyraźnie nie wykazano, że badanie było niewiarygodne z przyczyn niezależnych od produktu.
Badanie można uznać za niewiarygodne tylko, gdy jeden lub więcej z poniższych warunków jest spełniony:
- wyniki mikrobiologicznej kontroli pomieszczenia, sprzętu i materiałów wykazały nieprawidłowość,
- w trakcie oceny procedury wykonanego badania stwierdzono nieprawidłowości w jego przebiegu,
- stwierdzono wzrost drobnoustrojów w kontroli ujemnej,
- po zidentyfikowaniu wyizolowanych drobnoustrojów, można wzrost danego gatunku jednoznacznie powiązać z błędami związanymi z materiałem lub stosowaną techniką.
Jeżeli badanie zostanie uznane za niewiarygodne, trzeba przeprowadzić ponownie badanie w takich samych warunkach jak badanie pierwotne. Jeśli w powtórzonym badaniu nie stwierdza się wzrostu drobnoustrojów, badany produkt spełnia wymagania badania jałowości, natomiast jeżeli stwierdzimy wzrost produkt nazywamy niejałowym.
Osobny artykuł: Czym jest pH roztworu?
Bibliografia:
- Farmakopea Polska wyd.VIII, suplement 2010.
- „Mikrobiologia” P. R. Murray, K. S. Rosenthal, M. A. Pfaller, wyd. 8, 2018.
